2024年10月31日，上海交通大学医学院上海市免疫学研究所吴学锋课题组联合李斌课题组在The Journal of Clinical Investigation杂志在线（In-Press Preview）发表了题为“TMED4 facilitates Treg suppressive function via ROS homeostasis in tumor and autoimmune mouse models”的研究论文。该研究揭示了内质网应激反应蛋白TMED4通过介导IRE1α-XBP1信号轴依赖的细胞活性氧（ROS）水平维持调节性T（Treg）细胞的Foxp3稳定性及免疫抑制功能的作用机制。通过IRE1α -XBP1信号通路和NRF2相关的抗氧化反应，TMED4促进Treg细胞ROS稳态，从而维持细胞Foxp3的表达及抑制功能。缺失TMED4的Treg细胞在小鼠肿瘤模型和自身免疫疾病模型中均促进了效应性T细胞的活化，进而提高抗肿瘤免疫力或加重自身免疫疾病症状。

调节性T细胞（Treg）作为CD4+T细胞的独特亚群，具有免疫抑制功能，维持免疫稳态。Treg细胞重要标志是表达转录因子Foxp3，后者调控Treg细胞的分化和功能。炎症微环境及诱导慢性内质网应激（ERS）的药物可能导致Foxp3蛋白稳定性受损，使Treg转变为效应T细胞样表型，从而促进自身效应性T细胞和其它先天免疫细胞的激活，这一转变成为许多自身免疫疾病出现的导火索。内质网应激调控Foxp3稳定性和Treg功能的机制不清楚。内质网（ER）是分泌蛋白折叠和质量控制的中心，错误折叠的蛋白通过内质网相关降解（ERAD）途径被识别并降解。在应激条件下，未折叠或者错误折叠的蛋白的积累激活三条内质网应激反应通路：IRE1α、PERK和ATF6，其中IRE1α被认为是ERAD复合体的内源性底物，其降解涉及E3泛素连接酶HRD1和未折叠蛋白反应（UPR）分子伴侣BIP。IRE1α 在Treg细胞中由ERAD介导的降解机制仍待探讨。已有研究表明酵母p24蛋白（TMED4）可以防止错误折叠的蛋白进入内质网分泌的囊泡，并且其表达能被多种ERS诱导剂激活，TMED4是否参与Treg细胞ERS调控及其具体机制仍然不为所知。内质网应激反应在T细胞和Treg细胞中发挥着重要作用。与其他CD4+T细胞不同，Treg细胞主要依赖线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）来满足其能量需求；另外，内质网应激反应和线粒体OXPHOS缺陷是细胞活性氧（ROS）的主要来源，抗氧化转录因子NRF2参与清除ROS。由于内质网应激诱导的UPR高度依赖氧化还原信号的响应，线粒体OXPHOS和细胞ROS水平的波动将对Treg细胞的功能至关重要，并且Treg细胞中内质网应激反应、线粒体OXPHOS和抗氧化反应之间的相互作用机制和调控网络也需深入探索。

图1.在人的多种肿瘤中，TMED4与肿瘤浸润Treg细胞ERS相关基因和FOXP3表达呈正相关

本研究对癌症基因组图谱（TCGA）的多种癌症数据集（结肠癌（COAD）、直肠癌（READ）、肺腺癌（LUAD）、肝癌（LIHC）和胃癌（STAD））基因表达谱进行的相关性分析，揭示了ERS相关基因的表达谱以及Treg标志基因的表达谱与TMED4之间存在很强的正相关性。此外，对人类结直肠癌、胃癌和肾癌样本中分选出的CD4+CD25highTreg 细胞进行的mRNA表达相关性分析结果进一步发现，TMED4的表达与肿瘤浸润Treg细胞的ERS激活相关基因和FOXP3表达高度正相关（图1）。

图2. Tmed4缺失以细胞内在的方式下调Treg细胞的特征图谱和其体外抑制功能

为进一步探讨TMED4通过ERS参与调控Treg细胞功能的机制，作者通过对比野生型和Tmed4在Treg中特异性敲除小鼠（Tmed4ΔTreg）的表型，发现Tmed4ΔTreg小鼠相比于野生型小鼠表现出脾脏肿大、体重下降以及非淋巴器官淋巴细胞浸润增加等自身炎症表型，流式分析显示Tmed4ΔTreg小鼠淋巴器官中T细胞高度活化且分泌更多的炎症因子IFN-γ和IL-17。此外，本研究通过RNA-seq、体外抑制实验、骨髓过继转移模型（Bone marrow chimera）和嵌合体雌性小鼠模型（Female Chimera）等综合验证了TMED4以细胞内在的方式在维持Treg细胞Foxp3以及其他重要Treg表征分子的稳定表达和正常抑制功能中发挥着重要作用。为探究Tmed4缺失对Treg细胞在体内对病理生理的影响，本研究利用实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型（EAE）、T细胞诱导的慢性肠炎模型（T cell-induced chronic colitis）以及MC38皮下瘤小鼠模型，揭示了Tmed4缺失会促进效应性T细胞，尤其是Th1和CD8+T细胞的活化，导致小鼠自身免疫性炎症的恶化和促进抗肿瘤免疫。

图3. ROS清除剂或NRF2诱导剂可回补Foxp3的表达和Tmed4缺失的Treg细胞的抑制功能

研究团队进一步发现Tmed4的缺失显著下调IRE1α蛋白水平及其下游XBP1信号通路。Seahorse实验揭示了Tmed4缺失导致Treg细胞线粒体受损，使其更依赖于糖酵解途径而非氧化磷酸化，胞内总体ROS及线粒体ROS水平明显上调。通过ROS清除剂NAC以及NRF2诱导剂均能够在体内外有效回补Treg细胞Foxp3的表达和抑制功能（图3）。此外，本研究还通过Ern1ΔTreg（Treg中特异性缺失IRE1α）小鼠、IRE1α 通路抑制剂（4μ8C和KIRA6）处理、IRE1α 蛋白回补（Sindbis病毒过表达）以及PERK通路抑制（siRNA抑制PERK表达）等方法揭示了TMED4特异性通过IRE1α-XBP1信号轴调控Treg细胞Foxp3表达和抑制功能的机制。

图4. TMED4抑制HRD1/BIP介导的IRE1α降解

由于IRE1α蛋白水平的下调是TMED4缺失的Treg细胞功能受损的主要原因，本研究验证了TMED4促进IRE1α、HRD1（ERAD复合物组分）及BIP结合。TMED4通过抑制ERAD介导的IRE1α蛋白的K48泛素化降解，进而维持IRE1α 蛋白水平（图4）。

图5. 图文摘要（左）及封面图构思（右）：TMED4在Treg中维持ER应激反应和线粒体活性以避免细胞ROS过度积累导致Foxp3表达和细胞抑制功能受损（左）；取《西游记》孙悟空师徒过火焰山之意，孙悟空三借芭蕉扇（内质网）扑灭火焰山火（损坏的线粒体产生的活性氧）（右）。

综上，本研究揭示了TMED4在平衡ER应激反应和ROS中所起的作用（图5），揭示靶向TMED4调控的Treg细胞抑制功能可以作为自身免疫性疾病和抗肿瘤免疫的有效策略。

上海市免疫学研究所吴学锋组直博生蒋真言、王会子，李斌组博士后王晓霞和重庆师范大学郝友进组研究生朵泓睿为本文的共同第一作者，吴学锋研究员、李斌研究员以及郝友进教授为共同通讯作者。该工作得到了免疫所苏冰教授，上海交通大学医学院附属瑞金医院消化内科王正廷副主任医师，武汉大学生命科学学院刘勇教授，上海交通大学基础医学院侯照远研究员和张鹏研究员等大力支持。该研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、上海市科委等基金项目资助，以及上海交通大学基础医学院和上海市免疫学研究所公共技术平台和行政管理部门的支持。

文章链接：https://www.jci.org/articles/view/179874