近日，上海交通大学医学院-国家热带病研究中心全球健康学院殷堃课题组在分析化学领域顶刊《Analytical Chemistry》在线发表了题为“Enhanced Two-Step LAMP-CRISPR Assay with an Engineered Zst Polymerase for Contamination-Free and Ultrasensitive DNA Detection”（doi: 10.1021/acs.analchem.4c03965）的研究论文。该研究开发了一种增强型两步法LAMP-CRISPR检测策略，利用一种工程化Zst聚合酶突变体高效聚合四种寡核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和dUTP），无需添加dTTP即可高效完成LAMP反应，并利用体系中预混的UDG酶彻底清除反应环境中所有尿嘧啶-LAMP扩增子形成的气溶胶污染，从而实现超灵敏免污染DNA检测，解决LAMP-CRISPR反应中存在的假阳性干扰、反应效率偏低、灵敏度不足等问题；进一步将该方法在85例宫颈癌筛查患者的宫颈拭子样本中进行临床验证，检测精确度高达98.8%，实现了对临床病原体的免污染、超灵敏即时诊断，该策略在临床病原体、生物标志物及其他关键生物靶标的快速、灵敏诊断方面显示了重大潜力。

近年来，CRISPR/Cas系统凭借其高效反式切割单链DNA或RNA的特性，展现出成为下一代分子诊断技术的巨大潜力。结合一系列核酸扩增技术（如PCR、LAMP等）的CRISPR/Cas技术，特别是CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13，已被广泛应用于开发病原体的诊断新策略。其中，LAMP技术仅通过一种DNA聚合酶即可实现指数级等温扩增，反应简单且扩增高效，因此常与CRISPR技术结合实现两步法或一步法核酸检测。其中，两步法LAMP-CRISPR中，LAMP试剂和CRISPR试剂互不干扰，因此保证了较高的反应灵敏度，然而，LAMP反应结束后需要进行开盖移液，这一操作不仅延长了反应周转时间，还可能导致高浓度扩增子的气溶胶污染，从而显著增加假阳性风险。为了解决这一问题，研究人员将LAMP试剂和CRISPR试剂置于同一试管中，开发了一系列一管式LAMP-CRISPR方法。例如开发“两步法一管式”LAMP-CRISPR策略，通过物理隔离两步反应试剂，预先将CRISPR试剂置于试管内壁或管盖，先进行LAMP反应，再通过离心或轻微摇晃试管触发第二步CRISPR反应；或者开发直接混合LAMP反应试剂和CRISPR反应试剂的“一步法一管式”LAMP-CRISPR策略等。然而，上述的一管式LAMP-CRISPR方法也存在一些弊端，例如操作稳定性不佳造成的检测结果不可靠、装置密闭性不良导致的气溶胶污染等问题；另外，由于LAMP和CRISPR反应体系的不兼容性，一管式LAMP-CRISPR会牺牲一部分反应效率和灵敏度，因此，需要开发更加高效、免污染的LAMP-CRISPR策略。

因此，为了彻底解决LAMP-CRISPR反应存在的气溶胶污染、灵敏度不佳等问题，本研究首次开发了一种基于突变型工程化Zst聚合酶的增强型两步法LAMP-CRISPR检测策略。该策略利用工程化的突变型Zst DNA聚合酶高效聚合四种寡核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和dUTP），无需添加dTTP即可实现高效的LAMP反应。同时，通过预先加入的UDG酶消除环境中可能存在的尿嘧啶，从而彻底消除气溶胶污染导致的假阳性干扰。本方法能够在一小时内实现人乳头瘤病毒的单拷贝检测，精确度高达98.8%，与金标准qPCR相似，为临床病原体、生物标志物及其他重要靶标的快速灵敏检测提供了更简便的解决思路，展现出广阔的应用前景。

       上海交通大学医学院-国家热带病研究中心全球健康学院硕士研究生解艺和上海交通大学医学院附属仁济医院江凯为本文的共同第一作者，上海交通大学附属仁济医院妇产科主任医师施君、东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室、营养与食品卫生学系丁雄研究员、上海交通大学医学院-国家热带病研究中心全球健康学院殷堃研究员为本文的共同通讯作者，本研究得到了国家自然科学基金、上海市自然科学基金等基金支持。

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.4c03965?ref=pdf